Бета-таласемия-генетично тестване (HBB)

Бета-таласемиите представляват група заболявания с автозомно-рецесивно генетично предаване, характеризиращо се с ниска скорост на синтез на β вериги на глобин.

Генният клъстер β е разположен на хромозома 11, простира се на дължина 50 kb и съдържа в следния ред: epsilon ген (ε), 2 гама гена (наречени G γ и A γ), псевдоген β (ψβ), a делта (δ) гена и β гена (наречен HBB), който кодира β -глобин 1. Всеки ген има 3 последователности, кодиращи протеини (екзони) и 2 области, които очевидно нямат роля в синтеза на протеини (интрони = интервенционни последователности), фланкирани от 5 'и 3' последователности, които също не се намесват в процеса на транслация. В 5 'края на всеки ген е промоторът, последователност, необходима за започване на транскрипция. Промоторът на β ген включва 3 последователности: TATA кутия, CCATT кутия и дублирани CACC мотиви. Както екзоните, така и интроните страдат от феномена на ДНК транскрипция в пратеник РНК; този процес се контролира от транскрипционни фактори, които се свързват с промотори и контролни елементи нагоре по веригата - подобрители - които значително увеличават скоростта на транскрипция. По този начин гените на β-глобин са под въздействието на основен усилващ елемент, наречен β-локус контролна област (β-CSF) (виж фигура) .

Феноменът на транскрипцията включва следните стъпки:

- действителната транскрипция: резултатът е РНК копие на гена, което включва комплементарните последователности както за екзони, така и за интрони;

- капсулиране и полиаденилиране (затваряне + полиаденилиране): прикрепване на специални нуклеотиди към 5 'и 3' края на РНК;

- сплайсинг: отстраняване на интрони от иРНК; след това РНК последователностите, съответстващи на екзоните, се "инонират" заедно 3 .

Бета таласемията се среща по-често при популациите в средиземноморския басейн, но други етнически групи могат да бъдат засегнати. Тежестта на дефекта е променлива. Нормалните хора имат 2 алела за β-глобин, така че β-таласемията може да възникне в хетерозиготно или хомозиготно състояние. Тъй като има голям брой мутации, свързани с β-таласемия, възможни са и случаи на хетерозиготност на съединения, които се появяват, когато човек има 2 мутантни гена.

Описани са две широки категории β-таласемия:

-β или таласемия (бета нулева таласемия): характеризира се с отсъствието на експресията на анормален β ген или по-рядко с неговото делеция; когато дефектът се появи в хомозиготно състояние (β o/β o), синтезът на β вериги и имплицитно на хемоглобин А е напълно засегнат;

-β + таласемия (бета плюс таласемия): характеризира се с намалена (но не отсъстваща) експресия на анормален β ген; когато дефектът се появи в хомозиготно състояние, има определено производство на хемоглобин A 1; 5 .

Съединените хетерозиготи за β-таласемия могат да имат 2 различни гена β o или β + или и двата гена β + и β 0 (β +/β o).

Клиничната картина е изключително променлива. Хетерозиготният статус на β-таласемия, наричан още β-таласемия или β-таласемия минор, в повечето случаи е клинично асимптоматично състояние. Хомозиготният статус или съставната хетерозиготност за β-таласемия обикновено води до тежък клиничен фенотип, наречен β-таласемия майор, при който засегнатите индивиди са зависими от кръвопреливането. Терминът междинна β-таласемия включва клинични състояния със средна тежест между леки и големи форми; Засегнатите хора са симптоматични и понякога могат да се нуждаят от кръвопреливане, но те не са от съществено значение за поддържането на живота 1 .

Генетично тестване

Понастоящем са известни повече от 200 мутации, свързани с β-таласемия, които могат да бъдат открити чрез различни техники на PCR, хибридизация със синтетични олигонуклеотиди или секвениране. .

В повечето случаи това са мутации, които се появяват в или близо до HBB гена (замествания на единични нуклеотиди, делеции или олигонуклеотидни вмъквания). В зависимост от засегнатото генетично събитие са описани три вида мутации:

-засягащи транскрипцията на β-глобин;

-което засяга обработката на иРНК (феномени на сплайсинг или полиаденилиране);

-които произвеждат ненормален превод на иРНК (глупости или мутации на рамки за четене) 3 .

Малък процент от случаите са резултат от голяма делеция на гена или контролните последователности, разположени нагоре по веригата 1; 2 .

По отношение на тежестта на индуцирания дефект, HBB генните мутации се разделят на две широки категории:

Препоръки за мутационен анализ

-установяване на прогноза по отношение на клиничния фенотип (молекулярна диференциация на основната междинна таласемия);

-проследяване на превозвачи във високорискови семейства;

-пренатална диагностика на бета таласемия 5; 6 .

Събран образец - кръвта ще дойде 4 .

Контейнер за прибиране на реколтата - вакуутан, съдържащ EDTA като антикоагулант 4 .

Количество реколта - колкото вакуумът позволява 4

Причини за отхвърляне да опиташ - използване на хепарин като антикоагулант; коагулирани или хемолизирани проби 4 .

Тествайте стабилността - 7 дни при 2-8ºC 4 .

Метод - пълен секвенсор HBB 4 .

Тълкуване на резултатите

Страна от бета-таласемия (хетерозиготен статус)

Хората с β-таласемия обикновено са асимптоматични; възможно е обаче в условия на хемопоетичен стрес (бременност, интеркурентни инфекции) да се появят прояви, свързани с анемия. Някои пациенти могат да имат спленомегалия.

Хемограмата показва характерни промени в еритроцитната серия: леко намаляване на стойността на хемоглобина, увеличен брой на еритроцитите, ниски стойности на индексите на еритроцитите VEM и HEM, ширина на разпределението на еритроцитите обикновено нормална. Средно хематологичните променливи се различават в β 0 и β + страните, въпреки че може да има значително припокриване. В случаите, когато α-таласемия съществува едновременно, хематологичните отклонения са по-слабо изразени.

В периферната кръвна намазка, заедно с микроцитоза, хипохромия, пойкилоцитоза, "прицелни" еритроцити, могат да се наблюдават базофилни пункции. Изследването на костния мозък показва повишена клетъчност поради еритроидна хиперплазия.

Диагнозата се основава на откриването на повишен процент на HbA2 чрез хемоглобинова електрофореза или чрез хроматографска техника (HPLC). Около една трета до половината от пациентите се свързват с повишен процент на HbF.

Делът на хемоглобина А2 корелира с типа мутация на бета-таласемия. По този начин в повечето случаи на хетерозиготност за β 0 или тежка β + -таласемия се регистрира процент от 4-5% HbA2, докато при леки форми на β + -таласемия процентът обикновено е 3,6-4,2%. По-високи проценти се откриват в страни, свързани с делеция на 5 'частта на HBB гена, както и в случаите на мутации на промотора или инициационния кодон.

Причини за β-таласемия с нормален HbA2

Съществуват и форми на β-таласемия с нормален процент HbA2, наречени тиха β-таласемия. Например, в случай на мутация C → G от позиция 6, 3 'в крайния кодон, се установява среден процент от 2,4%.

Ако човек има индекси на еритроцитите, предполагащи бета-таласемия, но нивото на HbA2 не е повишено, е важно да се изключат δβ-таласемия, хемоглобинопатия на Lepore и α-таласемия. Може да има γδβ-таласемия, но това състояние е много рядко. Някои пациенти с желязодефицитна анемия могат да имат атипични индекси на еритроцитите; особено децата могат да имат желязодефицитна анемия, придружена от увеличен брой еритроцити.

Ниското ниво на феритин показва дефицит на желязо, но не изключва диагнозата бета-таласемия.

Мутациите на HBB, свързани с незначителни или липсващи хематологични аномалии в хетерозиготния статус, представляват важни диагностични проблеми; тяхната идентификация е необходима, тъй като те могат да причинят клинично значимо състояние в хомозиготни или хетерозиготни съединения. Тези видове мутации могат да бъдат разделени на две групи:

-мутации, които причиняват "тиха таласемия" с индекси на еритроцитите и нормален процент HbA2;

-мутации, които причиняват "почти безшумна таласемия" с нормален HbA2 и променени индекси на еритроцитите.

Тези форми могат да бъдат открити само чрез генетично тестване. Някои мутации, като +1480 C → G в гръцката популация, са толкова леки, че почти винаги причиняват „тиха таласемия“. Мутациите, най-често отговорни за тази форма на таласемия, са -101 C → T и -92 C → T, свързани със следните средни стойности: VEM = 83,9 fL, HEM = 28,6 pg и HbA2 = 3,4%. "Почти безшумна таласемия" е резултат от малка група мутации, като CAP + 1 A → C в Индия и от време на време IVS-6 T → C в Средиземно море. Хетерозиготите за IVS-6 T → C показват следните диапазони на стойности: VEM = 60-78 fL и HbA2 = 3.2-4-6%.

Дефицитът на желязо намалява процента на HbA2 както при хората без дефекти в глобина, така и при тези с бета-таласемия. Това не е проблем за хора с генетична аномалия, придружена от значително увеличение на HbA2, но за тези с леки мутации, свързани с незначителни увеличения на HbA2 дефицитът на желязо маскира страната на бета-таласемията. Поради тази причина се препоръчва при пациенти с тежка или умерена желязодефицитна анемия първо да се коригира дефицитът на желязо, след което, ако промените в индексите на еритроцитите продължават, трябва да се измери процентът на HbA2. Изключение от тази препоръка ще бъде направено при бременни пациенти, при които диагнозата бета-таласемия трябва да бъде поставена незабавно. В тази ситуация е необходимо да се разследва партньорът; ако се открие в държава с бета-таласемия, ще се обмисли генетично изследване при бременни жени с гранични нива на HbA2.

Мегалобластната анемия може също да доведе до намалени нива на HbA2 и да попречи на диагностицирането на β-таласемия.

Асоциацията на променените индекси на еритроцитите с нормално ниво на HbA2 може също да е резултат от съвместното съществуване на δ-таласемия с β 0 или β + мутация, която индуцира висок процент на HbA2 (открит при гущери и кипариси). Knossos хемоглобинът е отговорен и за някои случаи на β-таласемия с нормално ниво на HbA2.

Едновременното присъствие на лека мутация на β-таласемия (като CAP + 1 A → C) и щам α 0 -таласемия или хомозиготен статус на α + -таласемия често води до диагностициране на силата на β-таласемия.

Β-таласемия страна с нормални индекси на еритроцитите и повишен HbA2

Някои хетерозиготни пациенти за някои варианти на лека β-таласемия могат да имат повишени нива на HbA2 в присъствието на нормални индекси на еритроцитите; това състояние е установено при някои пациенти с мутация -101 C → T.

В допълнение, съвместното съществуване на α и β-таласемия може да доведе до нормални индекси на еритроцитите чрез по-балансиран синтез на глобинови вериги, но с повишен процент на HbA2. Тази промяна е особено често при пациенти с делеции на два α гена или форма на неделеционна α-таласемия.

Придобитите аномалии, като тези, предизвикани от чернодробно заболяване, могат да повишат нивата на еритроцитите при пациенти с β-таласемия.

Всички тези примери илюстрират сложността на случаите на β-таласемия и трудностите при идентифицирането им, като генетичните тестове понякога са единственото разследване, което може да потвърди диагнозата .

Въпреки че повечето хора, хетерозиготни за мутация на β-таласемия, имат клиникопатологични характеристики, описани като незначителна таласемия (променена хематологична картина при липса на клинични прояви), някои от тях развиват спленомегалия, анемия, жълтеница и камъни в жлъчката, състояние, наречено β-таласемия. Фенотипът е подобен на междинния β-таласемия и е свързан както с неефективна еритропоеза, така и с хемолитичен компонент. Характерно е наличието на еритробласти с включвания (съставени от излишни α вериги и β-анормални вериги).

Описани са повече от 30 алела, които индуцират доминиращия фенотип на β-таласемия, включително мутации в 3 'региона на екзони 2 или 3, които причиняват значително количество мутантна иРНК. В резултат на това се синтезират пресечени или удължени β вериги, изключително нестабилни, които се утаяват с нормални α вериги 1 .

Той се отнася до клиничен фенотип, причинен от различни генетични аномалии. Тежестта на междинния β-таласемия варира от клинично състояние, придружено от забавяне на растежа и костни деформации, при които оцеляването е рядко възможно без кръвопреливане, до по-леки форми, подобни на β-таласемията, но свързани с по-висока степен. на анемия и спленомегалия.

Могат да се появят усложнения като: хиперспленизъм, камъни в жлъчката, претоварване с желязо, компресивни явления, упражнявани от маси екстрамедуларна хематопоетична тъкан върху жизненоважни органи.

Хематологичната картина включва аномалии, подобни на тези, предизвикани от типична хетерозиготна β-таласемия, но има по-висока тежест; заедно с микроцитоза, хипохромия, анизоцитоза, пойкилоцитоза, базофилни пункции, полихроматофилия и циркулиращи еритробласти.

Електрофорезата на хемоглобина или HPLC показва повишени нива на HbA2 (по-високи от тези, установени в страната с β-таласемия) и HbF.

Междинна β-таласемия може да се появи при пациенти с единия или и двата анормални β-гена. Тези, които са хомозиготни или хетерозиготни съединения за β-таласемичните алели, имат мутации, свързани с леки форми на β + -таласемия или имат подобряващи фактори, като съвместното съществуване на силата на α-таласемия или мутация, водеща до повишен синтез на γ верига под на хемопоетичен стрес. Тези, които имат само един анормален β ген, или имат доминираща форма на β-таласемия, или са свързани с мутации, които влошават дисбаланса на глобиновата верига, като хомозиготен или хетерозиготен статус за тройно α или четворно α (α гени, умножени по 3 или 4 пъти).

Генетичното тестване улеснява идентифицирането на аномалии, които определят фенотипа на β-таласемия междинен продукт 1; 5 .

Съединените хомозиготни или хетерозиготни пациенти за мутации на β-таласемия, които зависят от кръвопреливането, имат клинично състояние, наречено β-таласемия майор.

Болестта често се разпознава през първата година от живота, започвайки на възраст от 3 месеца; се характеризира с тежка анемия, придружена от ускорена еритропоеза, както в медуларния, така и в екстрамедуларния сектор. Хематопоетичното разширяване води до тежки костни деформации, особено на черепа и костите на лицето; екстрамедуларната хематопоеза води до масивна хепатоспленомегалия.

Поредицата от еритроцити има следните стойности: Hb = 3-7 g/dL, VEM = 50-60 fL, HEM = 12-18 pg. Кръвната цитонамазка включва изразена микроцитоза, хипохромия, изразена анизоцитоза и пойкилоцитоза, базофилни пункции, циркулиращи еритробласти с хемоглобинизация и дизеритропоетични особености.

В случаите на хомозиготна или съединена хетерозиготност за β 0-таласемия (β 0/β 0) хемоглобиновата електрофореза или HPLC техника показва наличието само на HbA2 и HbF; когато пациентите имат хомозиготност за β + -таласемия (β +/β +) или комбинирана хетерозиготност за β 0 и β + -таласемия (β +/β 0), HbA също присъства в до 35%.

При β-таласемия майор процентът на HbA2 може да бъде нормален, висок или от време на време нисък 1; 2 .

1. Барбара Дж. Бейн. Диагноза на хемоглобинопатия. Blackwell Science, 2001, 7-9; 73-93.

2. Катерина Борня Пиняти, Ренцо Галанело. Таласемии и свързани с тях нарушения на синтеза на хемоглобин. В Wintrobe`s Clinical Hematology, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-1118.

3. Корнел Миронел Никулае. Транскрипция (транскрипция). Биоинформатика. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/transcrierea.htm. Референтен тип: Интернет комуникация.

4. Лаборатория Синево. Специфични препратки към използваната работна технология през 2010 г. Тип на справка: Каталог.

5. Ренцо Галанело, Антонио Као. Бета-таласемия. Gene Reviews, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Интернет комуникация.

6. Talmaci R, Молекулярна диагностика на -таласемии. Напредък в биотехнологиите, том II. Изд. Ars Docendi, стр. 179-188, 2002.