Аеробна кръвна култура (с антибиограма според случая)

Главна информация

Кръвната култура е един от най-важните и деликатни методи за микробиологичната лаборатория. Кръвта като нормално стерилна, изолираща и идентифицираща бактерия или гъбички в кръвната култура има значително диагностично значение 13 .

Бактеремията е присъствието в кръвта на бактерии от септично огнище или увредена лигавица. Често бактериемичното състояние е лишено от клинична експресия или е придружено само от студени тръпки и треска, към които могат да се добавят симптоми и признаци на състоянието, причинило бактериемичното отделяне.

Септицемията е клиничният термин, който определя важна бактериемия с нередовна, непредсказуема и тежка клинична еволюция, придружена от студени тръпки, нередовна треска, токсимия, хипотония, прострация, полиморфни и различни обриви, тъканни или висцерални септични метастази. Тежестта на септичния синдром оставя на заден план симптомите на първичното инфекциозно огнище, което винаги трябва да се търси 1 .

Микроби, участващи в:

Staphylococcus aureus, Escherichia coli и други ентеробактерии, коагулаза-отрицателни стафилококи (SCN), Pseudomonas spp, Streptococcus spp, анаеробни бактерии, дрожди

Streptococcus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp

Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae

В зависимост от входната порта:

Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae

Ентеробактерии, строго анаеробни бактерии, Enterococcus spp.

Строго анаеробни бактерии, E.coli, Enterococcus spp.

Инфекции и запушвания на пикочните пътища

Enterobacteria, Enterococcus spp.

Принципът на кръвната култура

Кръвната култура е качествен тест за откриване на микроорганизми, присъстващи в кръвта. Кръвта, взета при условия на строга асептика, се засява в шишето за кръвни култури, чийто състав благоприятства развитието на аеробни, анаеробни и микроаерофилни микроби 11 .

Основните фактори за обогатяване, включени в околната среда, които благоприятстват развитието на микроби, са:

комбинация от пептони, казеин и желатин за прием на аминокиселини;
екстракт от мая за прием на витамини;
хемин и NAD, които позволяват развитието на хемофилус и насърчават растежа на хранителни микроби като Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp и други анаероби;
витамин В6, незаменим елемент в развитието на дефицитен стрептокок, открит при ендокардит и стафилококи;
CO2 важен елемент за растежа на микробите на вида: Neisseria, Brucella, Haemophilus, Streptococcus, Campylobacter.

Размножаването на бактериите обаче зависи и от редица фактори, независими от условията на култивиране: плътността на микробите в кръвта, степента им на размножаване, наличието в кръвта на някои инхибиторни вещества.

Възрастните бактериемия и фунгемия обикновено се развиват с малък брой циркулиращи микроорганизми (между 1-30 CFU/ml кръв). При новороденото, новороденото и малкото дете концентрацията надвишава 100 CFU/ml. Като цяло има пряко пропорционална връзка между тежестта на инфекцията, прогнозата и концентрацията на бактерии в кръвта. .

Бактериите, уловени в бутилката за кръвна култура, могат да бъдат:

непокътнати, свободни в плазмата, във фазата на активно размножаване и ще продължат да се делят бързо в бульона за кръвна култура или във фазата на покой и ще започнат да се размножават в края на латентната фаза, съответстваща на адаптацията към хранителната среда на флакона;
повече или по-малко повредени или маскирани от действието на системата антитяло-комплемент, антибиотици, полиморфонуклеарна фагоцитоза или моноцити и ще се развият след автолиза на левкоцитите, ако останат жизнеспособни;
L-образни бактерии (хранителни дефицити), чийто растеж изисква адаптирана среда (хипертонична и богата на растежни фактори) 12 .

Бактериалният растеж в кръвната култура може да се забави или предотврати, ако в хранителната среда не се използва антикоагулант, тъй като микроорганизмите могат да попаднат във фибриновия съсирек. В същото време някои антикоагуланти могат да бъдат токсични за определени патогени, точно като антибиотиците в кръвта. Тези пречки могат да бъдат премахнати с помощта на натриев полианетолсулфонат (SPS), нетоксичен антикоагулант, който насърчава растежа на бактериите чрез неутрализиране на бактерицидната активност на човешкия серум и инхибиране действието на антибиотици (стрептомицин, канамицин, гентамицин, полимиксин В). SPS може да има инхибираща роля върху някои щамове на Peptostreptococcus, Neisseria, ефект неутрализиран от присъствието на желатин в хранителната среда.

На пазара се предлагат полуавтоматични или компютъризирани компютърни системи за бързо откриване на бактерии в кръвни култури. Принципите, на които се базират тези системи, са многобройни. Споменаваме само тези, които използваме в лабораторията Synevo: директно откриване на производството на CO2, чрез:

-серийно сканиране на проби от газ в резултат на бактериален растеж във флакона с кръвна култура, както в системата BACTEC (BACTEC 9050);

-принуждаване на културната течност (под освободеното налягане на CO2) да премине в отделение за сигнали, откъдето може да бъде изследвано микроскопски и субкултивирано, както в OXOID SIGNAL SYSTEM 9 .

Препоръки за определяне

Това се прави по лекарско указание в определени клинични ситуации като:

• всички случаи с висока температура с неуточнен произход, особено ако са придружени от клинични признаци, предполагащи инфекция;

• пациенти с остър ендокардит;

• синдром, предполагащ системна инфекция със специфични микроби (ентерична треска, бруцелоза, лептоспироза);

• тежки локализирани инфекции (менингит, пневмония, интраабдоминално нагнояване).

Кръвната култура се мотивира и от:

• имунокомпрометирани пациенти (рак, наркомани);

• пациентът, който е подложен на медицинска агресия (катетър, диализа или операция) и има фебрилно състояние;

• в определени конкретни ситуации (бременна жена, сърдечен пациент, диабет, с бъбречна недостатъчност, чернодробна недостатъчност), когато пациентът има треска с неуточнен произход 8 .

Подготовка на пациента

Вземането на проби се извършва преди антимикробно лечение, в зависимост от прогностичната еволюция на фебрилната крива или когато пациентът сигнализира за появата на студени тръпки. Ако това е невъзможно, кръвта ще бъде взета непосредствено преди даването на нова доза антибиотик. Показано е да се вземат три прекъсващи проби в рамките на 24 часа; в спешни случаи ритъмът е на интервал от 30-60 минути 6 .

Събран образец - венозна кръв, за предпочитане на гладно (без гладуване), хиперлипемия може да предотврати доказателства за бактериален растеж в течната среда.

Избраната зона за пункцията е представена от вените на лакътя. Процедурата за вземане на проби спазва нормите за асептика и антисептика, необходими за избягване на замърсяване на пробата с бактерии, обитаващи кожната флора. След вземането на кръв, 10-милилитровата кръвна проба, събрана в спринцовката, се поставя в контейнера със среда за култура Signal чрез пробиване на гумената й капачка при условия на строга асептика. Бутилката се разклаща внимателно, за да се хомогенизира в масата на средата. За системата BACTEC събирането се извършва в контейнера за кръвокултури на принципа на вакуумно затворени системи.

Пробата се етикетира и транспортира възможно най-скоро от събирането до лабораторията, при температури, максимално близки до 37ºC (изотермична кутия) 8 .

Необходими материали - 10 ml стерилна спринцовка; флакон с хранителна среда Сигнал 8; бутилка със средна култура (BACTEC PLUS AEROBIC/F и PLUS ANAEROBIC/F 4; 10; 14, BACTEC PÈDS PLUS ™/F 5, подходяща за детски проби и малки обеми кръв) за системата BACTEC.

Количество реколта - възрастен: 10 ml; дете: 3-5 ml (сигнал) и между 3-10 ml при възрастни и 1-3 ml при дете (BACTEC) 8 .

Причини за отхвърляне на доказателствата

• неправилно събрани проби (не са спазени правилата за антисептика);

• неправилен транспорт 8 .

Изисква се обработкана след прибиране на реколтата - Сигнална система: прикрепена е разширителната камера, доставена в същия комплект. Инкубирайте при 37 ° C. Времето за инкубация в термостата и пробата е средно 7 дни. Необходима е продължителна инкубация при пациенти с подостър ендокардит, в проби, взети под антибиотична терапия (до 14 дни) или при проследяване на взискателни микроорганизми 8 .

Система BACTEC: сканирайте баркода върху бутилката към четеца на баркодове и поставете бутилката в посоченото положение. След като вратата се затвори, процесът започва автоматично. Устройството има капацитет от 50 бутилки. Той непрекъснато наблюдава флаконите с кръвна култура, инкубирани при 35 o C. Флаконите се разклащат непрекъснато, за да стимулират бактериалния растеж. Положителните флакони се сигнализират звуково и визуално. Системата автоматично извършва контрол на качеството на всеки 10 минути. Интегрираният софтуер управлява примерни данни 2 .

Метод на работа

А. За комплекта Signal-Oxoid; тя се състои от:

а) Сигнален контейнер за среда; съставът на тази среда позволява развитието на аеробни, анаеробни и микроаерофилни микроби, което причинява повишаване на налягането, открито от индикатора за растеж, адаптиран към бутилката (разширителната камера);

б) камера за разширяване на околната среда; в случай на размножаване на бактерии и повишаване на налягането, част от сместа кръв/бульон преминава в тази камера и показва бактериална активност (положителна кръвна култура) 4 .

Класическият метод се използва за проследяване на тестовете:

• Макроскопско - визуално - два пъти дневно изследване на флакони с кръвни култури за търсене на признаци на бактериален растеж. Външният вид на флакона може да бъде насочен към въпросната бактерия, например:

а) мътност - аеробни Грам-отрицателни бацили, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;

б) хемолиза - Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus spp;

в) производство на газ - аеробни и анаеробни Грам-отрицателни бацили;

г) съсиреци - Staphylococcus aureus.

• Микроскопско изследване на пресния препарат и на оцветената по Грам цитонамазка, направена от флакона с кръвна култура.

Забележка: постоянното разбъркване на контейнерите през първите 24 часа на инкубацията подобрява растежа на по-голямата част от аеробни бактерии 9; 15 .

Тълкуване на култури в системата на сигнала

Липса на растеж - средата в контейнера Signal остава чиста и не преминава през зеления ръкав на разширителната камера. През първите 6-12 часа инкубация могат да се направят слепи субкултури (инокулация върху шоколадов агар в атмосфера на СО2 при 35 ° С за още 48 часа или в тиазиколиран бульон с резазурин) и намазки, които ще бъдат оцветени по Грам (микроскопско изследване).

Съдовете за отсъствие ще бъдат повторно инкубирани и допълнително наблюдавани.

Положителна кръвна култура - ако в изследваната кръв има микроби, които са се размножили в хранителната среда (положителна кръвна култура), средата ще премине в разширителната камера и ще се издигне над зеления си ръкав.

Б. За системата BACTEC принципът на работа е следният:

Чрез метаболитната активност микроорганизмите във флакона освобождават CO2, а флаконите, съдържащи активационен маркер, който става флуоресцентен в контакт с CO2, откриват неговото присъствие. Фотодетекторът на камерата измерва нивото на флуоресценция и изпраща данните на компютъра. Измерването се интерпретира от системата според предварително програмираните параметри на позитивността. Компютърът идентифицира положителния флакон, който се сигнализира слухово и визуално чрез запалване на крушка. Графичното положение на положително открития флакон се появява на дисплея на устройството.

Като напълно автоматична система, флаконите се наблюдават на всеки 10 минути, което позволява незабавно откриване на положителни флакони .

Протоколът за мониторинг е 7 дни - но развитието на микроорганизмите може да бъде установено след 8 часа 2; 4; 10; 14 .

В. Положителните кръвни култури се обработват, както следва:

Сигнална система: Взема се малко количество среда от долната зона на разширителната камера. Достъпът до разширителната камера се осъществява през горната й част, чрез стерилна маневра. Тази маневра не може да замърси съдържанието на контейнера за сигнал.

Система BACTEC: чрез игла, прикрепена към бутилката, се взема количество среда, от която се правят намазки и се засяват върху хранителни среди 2 .

Взетата проба среда се използва за:

а) разстилане на намазки върху микроскопични стъкла; те се изследват след оцветяване по Грам. Във връзка с резултата от показанията се правят повторения.

б) трансплантация на твърда и течна среда в зависимост от микроскопски доказаните бактерии: агар-кръв/колумбийска кръв, агар-шоколад, Levine/MacConkey, Sabouraud с хлорамфеникол, тиогликолатов бульон с resazurin.

в) плочите се инкубират, в зависимост от микроскопичните бактерии, при температура от 35 deC-37 ° C при аеробни условия, в атмосферата с 5-7% CO2 или в анаеробиоза (GasPack + редуцираща смес) в продължение на 48-72 часа. Изследват се изолирани колонии.

г) тестове, необходими за идентификация: Catalase ID, стафилококов идентификационен комплект, стрептококов идентификационен комплект, Optokin дискове, фактори X, V и XV, политропна среда за ентеробактерии, оксидазна реакция, API тестове (API 20E, API 20NE, API NH и др.) тестове за идентифициране на дрожди. Идентификацията може да се извърши и автоматично в системата Vitek.

д) тестване на антибиотична или противогъбична чувствителност чрез дифузиметричен или автоматичен метод на Vitek 9 .

д. Пускане на резултатите

а) частичен резултат от оцветена по Грам цитонамазка - тя се записва и обявява по телефона;

б) краен резултат след изолиране, идентифициране на бактерията и изпълнение на антибиограмата или противогъбичното средство.

Тълкуването на крайния резултат се прави в зависимост от клиничния контекст и броя на положителните флакони спрямо събраните 9 .

• няколко положителни кръвни култури с патогенен зародиш;

• няколко положителни кръвни култури с общ коменсален зародиш в определен клиничен контекст;

• 1 положителна кръвна култура с известни патогенни микроби (Salmonella spp);

• 1 положителна кръвна култура с потенциално патогенни микроби в предизвикващ клиничен контекст като: Streptococcus pneumoniae при пневмония, ентеробактерии при инфекции на пикочните пътища, коагулаза-отрицателен стафилокок при катетърни инфекции.

• 1 положителна кръвна култура с коменсален зародиш без клиничен контекст: суперинфекция с коагулаза-отрицателен стафилокок, коринебактерии, негрупируем стрептокок;

• при депресирано имунно поле тези бактерии също се вземат под внимание;

• при нормално имунно поле кръвната култура се повтаря.

• пробата е събрана след антибиотична терапия;

• събирането е извършено късно по време на заболяването (появяват се антитела);

• недостатъчно количество събрана кръв;

• времето за наблюдение е твърде кратко;

• Неправилно избрана хранителна среда.

Положителни кръвни култури за няколко бактериални вида

Ако няколко бактериални вида са изолирани в един флакон или от различни флакони на един и същ пациент, те се наблюдават в следните ситуации:

• катетър, поддържан дълго време.

Изолирани бактериални видове в зависимост от вегетационния период

• през първите 1-2 дни растат: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, ентеробактерии;

• след 3 дни растат: неферментативни грам-отрицателни бацили, анаеробни бактерии;

• на 4-5 ден: Haemophilus spp и коагулаза-отрицателен стафилокок;

• на всеки 6-7 дни: видове Candida;

• на 9 дни: коринебактерии 9 .

Граници и смущения

• антимикробно лечение, приложено преди вземане на проби;

• замърсяване на кръвта с екзогенна флора;

• недостатъчно количество взета кръв;

• честота и време на неправилно установени реколти;

• неправилно избрана среда за инкубация и трансплантация;

• неподходящо време за инкубация 1; 6; 12 .

1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Коагулаза-отрицателни стафилококи, изолирани от различни кожни лезии. В D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Тип справка: вестник (пълен).

2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Системи за микробиология Becton Dickinson, Sparks, Maryland 21152 USA, 1997

3. Думитру Буюк. Кръвна култура при диагностициране на инфекция. В трактата по клинична микробиология. Думитру Буюк, Мариан Негут, Медицинско издателство, Румъния, 2-ро изд. 2008, 165-182.

4. Goldenbaum P., Stafford E., Talbot B. Лабораторно изследване на неутрализацията на антимикробни средства чрез съдържаща смола среда за кръвно култивиране, Шести европейски конгрес по клинична микробиология и инфекциозни болести, 1993, 28-31.

5. Hardy L., Crowther L., Goldenbaum P., Beaty S . Шести Европейски конгрес по клинична микробиология и инфекциозни болести, 1993, 28-31.

6. Джоузеф М. Чивета, Робърт У. Тейлър, Робърт Р. Кърби. Критична грижа. В Lippincott Raven изд. 1997; 28: 405-412.

7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Multicenter Comparison of High Volume (10ml) nr BACTEC Plus и Standard (5ml) nr. Система BACTEC. В Diagn. Микробиол. Инфектирайте. Dis., 1991, 14: 111-8.

8. Kumar P.J., Clark M.L. В клиничната медицина. Bailliere Tindall, Великобритания, 2-ро изд. 1990, 710-720.

9. Лаборатория Синево. Специфични препратки към използваната работна технология през 2010 г. Тип на справка: Каталог.

10. Levievre H., Gimenez M., Vandenesch F. и сътр. Многоцентрово клинично сравнение на съдържащите смола бутилки със стандартни аеробни и анаеробни бутилки за култура на микроорганизми от кръв. В Eur.J. Clin. Микробиол. Infect.Dis., 1997, 16: 669-674.

11. Loulergue J., Avril J. L., Omwanga D. Hemocultures. При изследване на патологични продукти. Maury- Imprimeur S.A. изд. 1987, 41-45.

12. Филипона А., Пол С., Невот П. Хемокултура. В Rev.Prat, 33: 1929-38. 1983. Тип справка: вестник (пълен)

13. Reimer L.G, Wilson M.L., Weinstein M.P. Актуализация относно откриването на бактериемия и фунгемия. В Clin. Микробиол. Откр., 10: 445-465. 1997. Тип справка: вестник (пълен).

14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Предимство на комбинирането на смола с литична BACTEC среда за кръвна култура. В J. Clin. Microbiol., 1997, 35 (10): 2634-8