Хиперхомоцистеинемия и репродуктивна патология

хиперхомоцистеинемия и репродуктивна патология

Веачеслав Мошин, Алина Хотинеану, Адриан Крецу, Витали Скурту, Юлияна Холбан

Статия, публикувана в "Бюлетин по перинатология" от Rep. Молдова, през 2014 г., № 1 (61)

Хиперхомоцистеинемията определя състоянието, в което концентрациите на непротеиновата аминокиселина - хомоцистеин - надвишават нормалните граници. Мутациите в гените на цикъла на фолиева киселина (MTHFR, MTR, MTRR) имат основен принос, особено заедно с диета без витамини, особено от комплекс В. В момента хиперхомоцистеинемията е рисков фактор за усложнения при бременност, като: плацентарна руптура, прееклампсия, дефекти на нервната тръба, вътрематочно ограничаване на растежа, спонтанни аборти. Във връзка с това хомоцистеинът е токсичен за кръвоносните съдове и може да предизвика каскада от съдови усложнения, включително образуване на тромби. Генетичното тестване на пациентите ще позволи да се направи оценка на риска от хиперхомоцистеинемия и тромбоза, с указание за подходящо лечение и проследяване на бременността.

хиперхомоцистеинемия

Хомоцистеинът (Hcy) е съдържаща сяра непротеинова аминокиселина, отсъства в естествената диета и метаболитен междинен продукт в реакциите на трансметилиране и транссулфуриране - важни реакции при нормалния клетъчен растеж, функция и диференциация [8]. В кръвната плазма Hcy се намира в различни форми: 70% от общия хомоцистеин (tHcy) циркулира в свързана с протеини форма чрез дисулфидни взаимодействия (главно албумин) [19]; около 25% се намират под формата на хомоцистеинови димери, а останалите (5%) - свързани с други тиоли, включително цистеин, намалена Hcy и окислена [22].

Нивата на Hcy в плазмата се увеличават с възрастта поради метаболитния спад на Hcy в бъбреците. Жените имат по-ниски нива на Hcy от мъжете, отчасти поради влиянието на половите хормони (естроген и прогестерон) и менструацията [20].

При оптимални физиологични условия количеството Hcy на клетъчно ниво се регулира от два алтернативни метаболитни пътя: необратимо разграждане чрез транссулфуриране или реметилиране с образуване на метионин [3]. Трансулфуризацията, която се проявява особено в черния дроб и бъбреците, се състои в кондензация на Hcy със серин, в резултат на което се получава цистатионин с участието на ензима цистационин-β-синтаза и витамин В6 като кофактор. В следващия етап цистационин-γ-лиазата разгражда цистатионин до цистеин и а-кетобутират. Цистеинът се окислява до серния атом, за да образува неорганичен сулфат, екскретиран в урината [3]. От друга страна, цистеинът е предшественик на глутатиона - антиоксидант, необходим за детоксикацията на ксенобиотиците.

Алтернативно, Hcγ се реметилира до метионин, като се използва донор на метил-5-метилтетрахидрофолат (5-метилTHF) или бетаин [16]. По този начин метаболизмът на Hcy е тясно свързан с фолатния цикъл: ензимът метионин синтаза (MTR) катализира прехвърлянето на метиловата група от 5-метилTHF към Hcy с образуването на метионин и THF (тетрахидрофолат), реакция, която протича във всички клетки с изключение на еритроцитите. MTR изисква кофактор кобаламин (Cbl) и образуваният комплекс Cbl (I) MTR свързва метиловата група, което води до метилCbl (III) MTR. След прехвърляне, Cbl (I) MTR се реформира и може да приеме друга метилова група. В същото време кобаламинът леко се окислява до формата Cbl (II) и комплексът Cbl (II) MTR става неактивен. Друг ензим - метионин синтаза редуктаза (MTRR) - има функцията да активира отново Cbl (II) MTR комплекса чрез редуктивно метилиране [14].

Впоследствие превръщането на THF в 5,10-метилен THF се катализира от ензима MTHFD1 и зависи от ензима да възстанови метиловата група до Hcy реметилиране. MTHFR който намалява 5,10-метиленTHF до 5-метилTHF, като кофакторът е витамин В2 (рибофлавин).

Фигура 1. Метаболизъм на хомоцистеин: път на реметилиране на метионин и път на транссулфуриране с образуване на продукти като цистеин и сулфат

Хиперхомоцистеинемия (HHcy)

HHcy е следствие от ензимен дефицит и/или хранителен дефицит на витамини, които пречат на нормалния метаболизъм на метионин и/или Hcy. Увеличението на извънклетъчната концентрация на Hcy е токсично за клетките и тъканите и може да инициира каскада от съдови усложнения [25]. Нормалните граници на Hcy са между 5 и 15 μM [11]. По-високи стойности са свързани с формите: междинен (15-30 μM), умерен (30-100 μM) и тежък (> 100 μM) на HHcy [12]. Съществува сложно взаимодействие между генетични, метаболитни и фактори на околната среда, за да се поддържат нивата на хомоцистеин в нормални граници. Промените във фактор или комбинации от фактори могат да повишат нивото на tHcy (общ хомоцистеин). Според Steeed [25] са проучени 4 условия, които обясняват развитието на HHcy: 1) диета, богата на метионин; 2) недостиг на витамини (В12, В6 и фолиева киселина);
3) бъбречна дисфункция; 4) генетични аномалии (в гените MTHFR, MTR, MTRR, CBS).

Фигура 2. Фактори на хиперхомоцистеинемия (HHcy): 4 пътя за натрупване на хомоцистеин

Нека ги разгледаме по-подробно:

1) Половината от количеството метионин, получено чрез прием на храна, се превръща в Hcy [7]. Проучванията при животни предполагат, че богата на метионин диета в присъствието на дефицит на витамини В6, В12 и фолиева киселина може да увеличи риска от атеросклероза и коронарна съдова болест, докато диета, богата на растителни храни и плодове, поддържа нивата на Hcy в нормални граници [1].

2) Кофактори, получени от витамини от B-комплекс (B2, B6, B9, B12) участват в ензимни реакции, които регулират метаболизма на Hcy. Няколко проучвания показват, че хората с хиперхомоцистеинемия имат неадекватни концентрации на един или повече ензимни кофактори [23]. А концентрацията на Hcy е обратно пропорционална на плазмената концентрация на фолат, витамин В12 и В6 [10]. Фолиевата киселина (разтворимата форма на витамин В9) е необходима при клетъчното делене и диференциация, особено по време на бременност. Производните на фолиева киселина са донори на моно-карбонови единици за синтеза на пуринови и пиримидинови компоненти на ДНК и РНК, а чрез клониране на металната група - участват в епигенетичната регулация.

3) Бъбреците представляват основното място на метаболизма на Hcy, притежаващо 3-те ензима: MTR, CBS и цистационин-γ-лиаза [9]. Бъбречната дисфункция е придружена от повишаване на нивото на tHcy, а проучванията на Arnadottir показват обратно пропорционална връзка между измерената скорост на гломерулна филтрация и нивото на tHcy.

4) Генетичните аномалии в ензимите на метаболизма на Hcy могат да причинят повишаване на концентрацията на tHcy и тежестта на промените зависи от мястото на генната мутация [25]. Най-приетият полиморфизъм, свързан с променливостта на Hcy, е 677C> T в гена MTHFR, който замества Ala в Val в ензимния състав. Kang et al. идентифицира вариант на ензима MTHFR, характеризиращ се с ниска активност и "термолабилност" [13]. Ензимната активност в случай на хетерозиготни CT и хомозиготни TT генотипове е намалена съответно с 35% и 70% [25], а термолабилната форма е генетичен маркер на умерена HHcy при субекти с 677TT генотип (3). В същото време тази връзка се наблюдава само едновременно с неадекватни концентрации на фолиева киселина. Проучванията на Guenthler (1999) показват в модела на E.coli, че отслабването на FAD свързването е отговорно за намаляването на ензимната активност, а защитната роля срещу загубата на FAD дори се играе от фолацията [6].

Полиморфизмът 1298A> C на гена MTHFR се състои в обмена на Glu с Ala. От значение е, че нито хомозиготният, нито хетерозиготният статус на полиморфизма променя нивото на Hcy в плазмата [15]. Състоянието на хетерозиготно съединение за C677T и A1298C е свързано с намалена ензимна активност, високи нива на Hcy и ниски концентрации на фолат в плазмата [5].

В полиморфизма 66A> G на гена MTRR изолевцинът е заместен с метионин. Някои изследвания съобщават за този полиморфизъм като рисков фактор за DTN (дефекти на нервната тръба) [21].

Хомоцистеин и сърдечно-съдови заболявания

Първите доказателства за потенциалните отрицателни ефекти на Hcy върху съдовата стена са съобщени от McCully през 1969 г. [18]. Подобни съдови лезии са открити при 2 пациенти с тежка HHcy поради вродени грешки в метаболизма на Hcy, а „Теорията на хомоцистеина“ постулира, че Hcy и нейните производни са токсични за кръвоносните съдове. От друга страна, резултатите от мета-анализи, обхващащи 24100 субекта, показват, че терапията за нормализиране на хомоцистеина не намалява риска от миокарден и мозъчен инфаркт, което се обяснява с факта, че тези тестове се основават на предписването на фолиева киселина [17]. Допълването на фолиевата терапия е от полза от една страна, но антагонистичният ефект е да ускори пролиферацията и възпалението - основни процеси при образуването на атеросклеротична плака, главно поради ролята на метаболизма на фолатите за осигуряване на моновъглеродни единици за синтез на пурин и пиримидеин в структурата на ДНК. РНК [4].

Последните проучвания описват 3 патологични механизма, залегнали в основата на съдови усложнения, причинени от Hcy: оксидативен стрес, ендотелна дисфункция и съдово ремоделиране - интегрирани в "токсичната триада" [4].

Фигура 3. Токсична триада: Патологични механизми, лежащи в основата на съдови заболявания, причинени от хомоцистеин.

Изследванията показват, че Hcy атакува предимно съдовия ендотел и инициира каскада от съдови усложнения. Клинични наблюдения и изследвания върху животни са идентифицирали възможни цели на Hcy: EC (ендотелни клетки), VSMC (мускулни клетки), съединителни тъкани, тромбоцити, коагулационни фактори, липиди, NO (азотен оксид) молекули за предаване на сигнала [25 ]. Няма обаче единна хипотеза, която да обясни как Hcy причинява увреждане на кораба. Молекулните и клетъчните ефекти на HHcy са отразени в таблица 1.

Таблица 1. Механизми на хиперхомоцистеинемия

Молекулни ефекти на HHcy	Клетъчни ефекти на HHcy
Намаляване на производството на NO (азотен оксид)	Ендотелна дисфункция
Намаляване на наличното количество NO	Нарушена вазорелаксация на ендотелните клетки
Оксидативен стрес	Увреждане на митохондриите
Липидна пероксидация	Пролиферация на гладкомускулни клетки
възпаление	Разграждане на извънклетъчния матрикс
коагулация	Увреждане на ДНК и РНК
Образуване на тромби	апоптоза

Материали и методи: Изследователската група се състоеше от пациенти от Медицинския център с репродуктивни проблеми, включително спонтанни аборти и повтарящи се аборти. Геномна ДНК беше извлечена от специализирани комплекти (Mini Kit за пречистване на геномна ДНК за пълна кръв, Fermentas) от левкоцити от периферна кръв. Кръвни проби се събират в епруветки за еднократна употреба с EDTA чрез венепункция.

За генетично тестване на MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTR A2756G и MTRR A66G полиморфизми, PCR/RFLP (реакция на полимеризация на веригата и полиморфизъм на рестрикционна дължина на фрагменти) бяха проведени със специфични праймери, взети от статии 2 в литературата. 27.24]. Геномната ДНК се амплифицира с помощта на Dream Taq полимераза ("Fermentas", САЩ), в термоцикъла "TProfessional Basic 96" (Biometra, Германия). Условията на реакцията са сходни за всички полиморфизми, с изключение на температурата за подравняване на грунда: 60,4 ° C за MTHFR C677T, 61 ° C за MTHFR A1298C, 58,4 ° C - MTR A2756G, 57,6 ° C - MTRR A66G, а стандартните условия на протокола са: денатурация първоначално при 95 ° C - 3 минути, 33 цикъла: 94 ° C - 30 секунди, 57,6 - 61 ° C - 30 секунди, 72 ° C - 30 секунди и окончателно удължаване при 72 ° C - 5 минути.

Ампликоните бяха ограничени за 3 часа при 37 ° C с рестрикционните ензими, специфични за всеки полиморфизъм: Hinf I за MTHFR C677T, Mbo II за MTHFR A1298C, Hae III - MTR A2756G и Nde I - MTRR A66G.

Проверката на рестрикционните продукти се извършва чрез гел електрофореза PAAG (полиакриламид) в концентрация 7,5% - при условия: 200 V за 3 часа. Гелът се оцветява с разтвор на етидиев бромид. И резултатите бяха разгледани в системата UV SOLO (Германия). Размерите на фрагментите са отразени на фигура 4.

Фигура 4. Електрофореграма на PCR/RFLP анализ на генетичните полиморфизми на фолатния цикъл:

А) MTЗ.FR C677T: M - 50 bp маркер; 1 - ампликон (227 bp); 4 - 8 - нормален хомозиготен (205 bp); 2 - хетерозиготен (205, 129, 76 bp); 3 - хомозиготен след мутация (129, 76 bp);
Б) MTHFR A1298C: M - 50 bp маркер; 1 - ампликон (163 bp); 4 - нормален хомозиготен (56, 31, 30, 18 bp); 3, 5, 7 - хетерозиготни (84, 56, 31, 30, 18 bp); 2 - хомозиготен след мутация (84, 31, 30, 18 bp);
° С) MTR A2756G: 2, 3, 5, 6, 9 - нормален хомозиготен (421, 81 bp); 1, 4, 7, 8 - хетерозиготни (421, 269, 152, 81 bp); 10 - хомозиготен след мутация (269, 152, 81 bp);
Д) MTRR A66G: M - 50 bp маркер; 2-ампликон (145 bp); 5, 6 - нормален хомозиготен (145 bp); 4 - хетерозиготен (145, 123, 22 bp); 3 - хомозиготен след мутация (123, 22 bp).

Резултати и дискусии: Резултатите от генотипирането са представени на диаграми 1 - 4. За оценка на достоверността на получените резултати са използвани общоприетите формули от вариационната статистика с помощта на програмата SISA. В този контекст честотите на алелите и генотипните класове бяха изчислени по формулата на Харди-Вайнберг, а за сравняване на честотите на генотипите беше използван критерият на Пирсън - X 2 .

Диаграма 1. Честотно разпределение на генотипните класове чрез MTHFR C677T полиморфизъм

Диаграма 2. Честотно разпределение на генотипни класове чрез полиморфизъм MTHFR A1298C

Диаграма 3. Честотно разпределение на генотипни класове съгласно полиморфизма MTRR A66G

Диаграма 4. Честотно разпределение на генотипни класове чрез полиморфизъм MTR A2756G

При сравняване на честотното разпределение на наблюдаваните генотипове и тези, теоретично очаквани от теста X 2, не е изяснено статистически значимо отклонение от равновесието на Харди-Вайнберг за изследван полиморфизъм: MTHFR C677T (X 2 = 0,575; p> 0,05); MTHFR A1298C (X2 = 3.766; p = 0.052); MTR A2756G (X2 = 2,332; p> 0,05); MTRR A66G (X2 = 2230; р> 0,05);

1) Хомоцистеинът в големи количества има токсичен ефект върху ендотела на кръвоносните съдове, стимулиращ образуването на тромби.

2) Хиперхомоцистеинемията е рисков фактор за усложнения на бременността по различно време, включително прееклампсия, отлепване на плацентата, вътрематочно ограничаване на растежа и спонтанни аборти.

3) Генетичното тестване след мутации в гените на метаболизма на хомоцистеин и фолиева киселина позволява оценка на риска и предписване на подходящо лечение.